Please enable / Bitte aktiviere JavaScript!
Veuillez activer / Por favor activa el Javascript![ ? ]
niedziela, 04 grudnia 2011 00:07

Wykrywanie związków biologicznych

Oceń ten artykuł
(0 głosów)

Cukry

 

Wykrywanie cukrów

Ogólną reakcją służącą wykrywaniu cukrówjest reakcja Molischa zachodząca pomiędzy produktami powstającymi z cukrów pod działaniem stężonych kwasów mineralnych a α-naftolem. W podwyższonej temperaturze cukry pod działaniem kwasów mineralnych zostają odwodnione. Produktami tego odwodnienia są furfural lub jego pochodne - zależy to od rodzaju cukru, który został odwodniony. Sam furfural powstaje między innymi w procesie odwadniania pentoz. Furfural i jego pochodne dają barwne związki w reakcji z niektórymi odczynnikami organicznymi (np. fenolami). W opisywanej reakcji Molischa odwodnione cukry reagują z α-naftolem. Do doświadczenia potrzebne są:

  • 1% roztwory cukrów: glukozy, fruktozy, sacharozy, skrobi itp.
  • stężony (98%) H2SO4
  • 10% roztwór α-naftolu w alkoholu etylowym
  • probówki
  • statyw

Do czterech probówek nalewamy po około 2 cm3 roztworów cukrów. Do piątej probówki odmierzamy 2 cm3 wody destylowanej. Następnie do każdej probówki dodajemy jeszcze po 1 cm3 wody destylowanej i po 2 krople 10% roztworu α-naftolu w EtOH. Po wymieszaniu zawartości każdej probówki do probówek wkraplamy po 1 kropli stężonego H2SO4. Na granicy warstwy kwasu obserwujemy powstawanie fioletowego zabarwienia w probówkach zawierających cukry.

 

Odróżnianie aldoz od ketoz

Podstawową reakcja mająca na celu odróżnienie aldozy od heksozy jest reakcja z odczynnikiem Sieliwanowa (roztwór rezorcyny w kwasie solnym). Rezorcyna daje z furfuralowymi pochodnymi cukrów barwne związki, przy czym zabarwienie występuje znacznie szybciej w przypadku gdy mamy do czynienia z ketozami. Do wykonania doświadczenia potrzebne będą:

  • 33ml stężonego (35%) HCl
  • 50 mg rezorcyny
  • 1 % roztwór glukozy (aldoza) i fruktozy (ketoza)
  • woda destylowana
  • probówki
  • statyw
  • łaźnia wodna

Sporządzamy odczynnik Sieliwanowa: do 66ml wodydestylowanej dodajemy 33ml HCl, a następnie 50 mg rezorcyny. Do dwóch oznaczonych probówek nalewamy po 1 ml wodnych roztworów: glukozy i fruktozy. Do każdej probówki dodajemy po 1 ml odczynnika Sieliwanowa. Probówki ogrzewamy przez 1 minutę na wrzącej łaźni wodnej. Po tym czasie w probówce z fruktozą (ketozą) wystąpi czerwone zabarwienie. Zabarwienie roztworu glukozy zachodzi po dłuższym ogrzewaniu.

 

Aminokwasy i białka

Ogólną reakcją na wykrywanie białek jest próba ninhydrynowa. Wszystkie aminokwasy z wyjątkiem proliny w środowisku o pH wyższym od 7 dają w reakcji z ninhydryną fioletowy produkt. Białka w tych warunkach również reagują z ninhydryną, dają jednak produkt o słabszej barwie niebieskiej. Do doświadczenia potrzebne będą:

  • 1% roztwór ninhydryny w etanolu
  • 1% roztwory wodne: albuminy (białko), glicyny, tyrozyny, cysteiny (aminokwasy)
  • probówki
  • statyw
  • łaźnia wodna

Do oznaczonych probówek odmierzyć po 1 ml roztworu glicyny, albuminy, cysteiny i tyrozyny. Do każdej probówki dodać po 1 ml roztworu ninhydryny. Ogrzewać przez 3 minuty na wrzącej łaźni wodnej. Aminokwasy dają wybarwienie fioletowe, natomiast białko - albumina - jasnoniebieskie.

 

Tłuszcze

Tłuszcze można łatwo wyekstrahować z surowców roślinnych rozpuszczalnikami niepolarnymi (benzen, chloroform, eter dietylowy). W wyekstrahowanych tłuszczach część kwasów tłuszczowych zawiera wiązaniapodwójne. Ilość tych wiązań określa stopień nasycenia tłuszczu. Wiązania podwójne łatwo przyłączają chlorowce, np brom z wodybromowej. Do doświadczenia potrzebne będą:

  • nasiona słonecznika lub innej rośliny oleistej 20 g
  • siarczan sodu bezwodny Na2SO4
  • woda bromowa 50 ml
  • chloroform 50 ml
  • moździerz
  • kolba płaskodenna 250 ml
  • parownica 200 ml
  • łaźnia wodna
  • rozdzielacz
  • lejek i sączek

W moździerzu ucieramy ze sobą 20 g nasion i 15 g bezwodnego siarczanu sodu. Roztarte nasiona przenosimy do kolby płaskodennej, zalewamy 50 ml chloroformu i silnie wytrząsamy. Następnie kolbę szczelnie zamykamy i zostawiamy na kilkanaście godzin. Sączymy ekstrakt, odparowujemy chloroform na wrzącej łaźni wodnej. Do 10 ml otrzymanej substancji dodajemy 1 ml wodybromowej. Obserwujemy zanikanie koloru wody bromowej i jednoczesne wytrącanie się brunatnego osadu. Jest to spowodowane addycją bromu do wiązania podwójnego w kwasach tłuszczowych lub tworzeniem się bromohydryny (równoczesną addycją atomu bromu i grupy OH).

 

Enzymy

 

Lipaza trzustkowa

W trzustce występuje enzym z grupy hydrolaz - lipaza, katalizująca rozkład tłuszczów prostych do gliceryny i wolnych kwasów tłuszczowych. W doświadczeniu zaobserwujemy uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych w wyniku działania lipazy trzustkowej na tłuszcze w mleku. Określenie ilości wolnych kwasów tłuszczowych przeprowadza się poprzez miareczkowanie roztworem zasady o określonym stężeniu. Do doświadczenia potrzebne będą:

  • trzustka wieprzowa 100 g
  • mleko pełnotłuste 200 g
  • roztwór mianowany KOH ok. 0,05 mola/dm3, 1 l
  • fenoloftaleina
  • papierki lakmusowe
  • cylinder miarowy 50 ml
  • biureta 100 ml
  • kolba płaskodenna 250 ml
  • łaźnia wodna
  • termometr
  • zlewka 500 ml

100 g trzustki należy rozdrobnić i dokładnie wymieszać z 200ml wody destylowanej o temperaturze około 37°C. Całość silnie wytrząsamy - jak najwięcej enzymu powinno przejść do fazy wodnej. Do kolb płaskodennych nalewamy po 100 ml mleka pełnotłustego. Kolby wstawiamy na łaźnię wodną o temperaturze około 37 °C (optimum działania enzymu). Do jednej kolby z mlekiem nalewamy 20 ml wyciągu enzymatycznego, do drugiej 20 ml wody destylowanej. Po 1 h miareczkujemy obydwa roztwory 0,05 mol/dm3 roztworem KOH.

C3H5(OOC17H35)3 → C3H5(OH)3 + 3 C17H35COOH
C17H35COOH + KOH → C17H35COOK + H2O

Do zobojętnienia 14,2 g kwasu powstałego z tłuszczu potrzebny jest 1 dm3 0,05 M KOH. W reakcji tej wytwarza się sól sodowa kwasu stearynowego - jest to mydło. Ze względu na to, iż jest to sól potasowa mydło to jest maziste i szare. Mydło to możemy oczyścić poprzez wysalanie roztworem NaCl.

 

Hydroliza białkapepsyną

Pepsyna jest głównym enzymem soku żołądkowego. Jest to proteaza która w środowisku kwaśnym hydrolizuje białkapokarmowe. Enzym ten można stosunkowo łatwo uzyskać w czystej postaci. Ma on zastosowanie w leczeniu osłabionej aktywności pepsynowej - czyli w przypadkach niedoboru tego enzymu. Do doświadczenia potrzebne będą:

  • pepsyna - do kupienia w aptece
  • woda destylowana
  • białko jaja kurzego
  • stężony HCl
  • wodorotlenek sodu NaOH
  • 4 probówki
  • statyw
  • termometr
  • łaźnia wodna
  • papierki uniwersalne
  • moździerz

Przygotowujemy potrzebne roztwory:

  1. W 10ml wodydestylowanej rozpuszczamy 1g pepsyny
  2. 4g białka ugotowanego na twardo jaja kurzego ucieramy w moździerzu ze 100 g wody na jednolitą masę tak, aby powstała zawiesina
  3. do 10 ml wody destylowanej dodajemy 5 ml stężonego HCl
  4. w 100 ml wody destylowanej rozpuszczamy 4 g NaOH

Do czterech probówek wkraplamy roztwory:

  1. 1 ml wody, 3 ml r-r białka
  2. 3 ml r-r białka, 1 ml pepsyny, 2 kropler-r HCl
  3. 3 ml r-r białka, 1 ml pepsyny, 2 krople r-r NaOH
  4. 3 ml r-r białka, 1 ml pepsyny

Probówki umieszczamy na 20 minut na łaźni wodnej ogrzanej do temperatury 40°C. Po upływie tego czasu w każdej z probówek wykonuje się reakcję z ninhydryną. W probówce zawierającej pepsynę i zakwaszonej roztworem HCl zawartość wolnych aminokwasów powstałych z enzymatycznego rozpadu białka jest największa, na co wskazuje najintensywniejsza barwa niebieska.

 

Amylaza słodowa (hydroliza skrobi)

W kiełkach zbóż dużą aktywność wykazują enzymy zwane amylazami hydrolizujące skrobię do mniejszych jednostek, nie dających reakcji z jodem (α-amylaza hydrolizuje skrobię do różnych cukrów, β-amylaza do glukozy). Do doświadczenia potrzebne będą:

  • homogenat z kiełków jęczmienia
  • roztwór skrobi
  • roztwór jodu w jodku potasu (jodyna, płyn Lugola)
  • moździerz
  • probówki
  • statyw
  • łaźnia wodna
  • termometr
  • zegarek
Przygotowanie homogenatu zbożowego

W kuwecie wyłożonej wilgotna lignina wysiewa się 5 g ziaren jęczmienia. Kuwetę przykrywa się folią plastikową i odstawia na 2-3 dni w ciemne miejsce. Bezpośrednio przed doświadczeniem 1 g kiełków uciera się w moździerzu z 5 ml zimnej wody destylowanej.

Przygotowanie roztworu skrobi

1 g skrobi uciera się w moździerzu z 5 ml zimnej wody na gładką zawiesinę. Zawiesinę tę wlewa się wąskim strumieniem do 500 ml wrzącej wody. Całość gotuje się prez 5 minut, po czym roztwór przelewa się do butelki i oziębia.

Przebieg doświadczenia

Do 4 ponumerowanych probówek dodaje się po 1 ml roztworu skrobi i 1 ml roztworu kiełków zbożowych. Do pierwszej probówki dodaje się natychmiast 2 krople roztworu jodu, wstrząsa i notuje zabarwienie jakie powstało. Pozostałe 3 probówki umieszcza się na łaźni wodnej o temperaturze 40°C. Po trzech minutach wyjmuje się probówkę drugą, dodaje do niej 2 krople roztworu jodu, wstrząsa i notuje zabarwienie. Trzecia i czwartą probówkę wyjmuje się odpowiednio po 10 i 15 minutach od włożenia, wykonując za każdym razem próbę z odczynnikiem jodowym.

Artykuł napisał
Ethernity

Czytany 13676 razy Ostatnio zmieniany środa, 07 grudnia 2011 21:21
Więcej w tej kategorii: Oznaczanie witaminy C »
Zaloguj się, by skomentować