| Wykrywanie związków biologicznych |
 |
 |
 |
Cukry
Wykrywanie cukrówOgólną reakcją służącą wykrywaniu cukrówjest reakcja Molischa zachodząca pomiędzy produktami powstającymi z cukrów pod działaniem stężonych kwasów mineralnych a α-naftolem. W podwyższonej temperaturze cukry pod działaniem kwasów mineralnych zostają odwodnione. Produktami tego odwodnienia są furfural lub jego pochodne - zależy to od rodzaju cukru, który został odwodniony. Sam furfural powstaje między innymi w procesie odwadniania pentoz. Furfural i jego pochodne dają barwne związki w reakcji z niektórymi odczynnikami organicznymi (np. fenolami). W opisywanej reakcji Molischa odwodnione cukry reagują z α-naftolem. Do doświadczenia potrzebne są:
Do czterech probówek nalewamy po około 2 cm3 roztworów cukrów. Do piątej probówki odmierzamy 2 cm3 wody destylowanej. Następnie do każdej probówki dodajemy jeszcze po 1 cm3 wody destylowanej i po 2 krople 10% roztworu α-naftolu w EtOH. Po wymieszaniu zawartości każdej probówki do probówek wkraplamy po 1 kropli stężonego H2SO4. Na granicy warstwy kwasu obserwujemy powstawanie fioletowego zabarwienia w probówkach zawierających cukry.
Odróżnianie aldoz od ketozPodstawową reakcja mająca na celu odróżnienie aldozy od heksozy jest reakcja z odczynnikiem Sieliwanowa (roztwór rezorcyny w kwasie solnym). Rezorcyna daje z furfuralowymi pochodnymi cukrów barwne związki, przy czym zabarwienie występuje znacznie szybciej w przypadku gdy mamy do czynienia z ketozami. Do wykonania doświadczenia potrzebne będą:
Sporządzamy odczynnik Sieliwanowa: do 66ml wodydestylowanej dodajemy 33ml HCl, a następnie 50 mg rezorcyny. Do dwóch oznaczonych probówek nalewamy po 1 ml wodnych roztworów: glukozy i fruktozy. Do każdej probówki dodajemy po 1 ml odczynnika Sieliwanowa. Probówki ogrzewamy przez 1 minutę na wrzącej łaźni wodnej. Po tym czasie w probówce z fruktozą (ketozą) wystąpi czerwone zabarwienie. Zabarwienie roztworu glukozy zachodzi po dłuższym ogrzewaniu.
Aminokwasy i białkaOgólną reakcją na wykrywanie białek jest próba ninhydrynowa. Wszystkie aminokwasy z wyjątkiem proliny w środowisku o pH wyższym od 7 dają w reakcji z ninhydryną fioletowy produkt. Białka w tych warunkach również reagują z ninhydryną, dają jednak produkt o słabszej barwie niebieskiej. Do doświadczenia potrzebne będą:
Do oznaczonych probówek odmierzyć po 1 ml roztworu glicyny, albuminy, cysteiny i tyrozyny. Do każdej probówki dodać po 1 ml roztworu ninhydryny. Ogrzewać przez 3 minuty na wrzącej łaźni wodnej. Aminokwasy dają wybarwienie fioletowe, natomiast białko - albumina - jasnoniebieskie.
TłuszczeTłuszcze można łatwo wyekstrahować z surowców roślinnych rozpuszczalnikami niepolarnymi (benzen, chloroform, eter dietylowy). W wyekstrahowanych tłuszczach część kwasów tłuszczowych zawiera wiązaniapodwójne. Ilość tych wiązań określa stopień nasycenia tłuszczu. Wiązania podwójne łatwo przyłączają chlorowce, np brom z wodybromowej. Do doświadczenia potrzebne będą:
W moździerzu ucieramy ze sobą 20 g nasion i 15 g bezwodnego siarczanu sodu. Roztarte nasiona przenosimy do kolby płaskodennej, zalewamy 50 ml chloroformu i silnie wytrząsamy. Następnie kolbę szczelnie zamykamy i zostawiamy na kilkanaście godzin. Sączymy ekstrakt, odparowujemy chloroform na wrzącej łaźni wodnej. Do 10 ml otrzymanej substancji dodajemy 1 ml wodybromowej. Obserwujemy zanikanie koloru wody bromowej i jednoczesne wytrącanie się brunatnego osadu. Jest to spowodowane addycją bromu do wiązania podwójnego w kwasach tłuszczowych lub tworzeniem się bromohydryny (równoczesną addycją atomu bromu i grupy OH).
Enzymy
Lipaza trzustkowaW trzustce występuje enzym z grupy hydrolaz - lipaza, katalizująca rozkład tłuszczów prostych do gliceryny i wolnych kwasów tłuszczowych. W doświadczeniu zaobserwujemy uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych w wyniku działania lipazy trzustkowej na tłuszcze w mleku. Określenie ilości wolnych kwasów tłuszczowych przeprowadza się poprzez miareczkowanie roztworem zasady o określonym stężeniu. Do doświadczenia potrzebne będą:
100 g trzustki należy rozdrobnić i dokładnie wymieszać z 200ml wody destylowanej o temperaturze około 37°C. Całość silnie wytrząsamy - jak najwięcej enzymu powinno przejść do fazy wodnej. Do kolb płaskodennych nalewamy po 100 ml mleka pełnotłustego. Kolby wstawiamy na łaźnię wodną o temperaturze około 37 °C (optimum działania enzymu). Do jednej kolby z mlekiem nalewamy 20 ml wyciągu enzymatycznego, do drugiej 20 ml wody destylowanej. Po 1 h miareczkujemy obydwa roztwory 0,05 mol/dm3 roztworem KOH. C3H5(OOC17H35)3 → C3H5(OH)3 + 3 C17H35COOH Do zobojętnienia 14,2 g kwasu powstałego z tłuszczu potrzebny jest 1 dm3 0,05 M KOH. W reakcji tej wytwarza się sól sodowa kwasu stearynowego - jest to mydło. Ze względu na to, iż jest to sól potasowa mydło to jest maziste i szare. Mydło to możemy oczyścić poprzez wysalanie roztworem NaCl.
Hydroliza białkapepsynąPepsyna jest głównym enzymem soku żołądkowego. Jest to proteaza która w środowisku kwaśnym hydrolizuje białkapokarmowe. Enzym ten można stosunkowo łatwo uzyskać w czystej postaci. Ma on zastosowanie w leczeniu osłabionej aktywności pepsynowej - czyli w przypadkach niedoboru tego enzymu. Do doświadczenia potrzebne będą:
Przygotowujemy potrzebne roztwory:
Do czterech probówek wkraplamy roztwory:
Probówki umieszczamy na 20 minut na łaźni wodnej ogrzanej do temperatury 40°C. Po upływie tego czasu w każdej z probówek wykonuje się reakcję z ninhydryną. W probówce zawierającej pepsynę i zakwaszonej roztworem HCl zawartość wolnych aminokwasów powstałych z enzymatycznego rozpadu białka jest największa, na co wskazuje najintensywniejsza barwa niebieska.
Amylaza słodowa (hydroliza skrobi)W kiełkach zbóż dużą aktywność wykazują enzymy zwane amylazami hydrolizujące skrobię do mniejszych jednostek, nie dających reakcji z jodem (α-amylaza hydrolizuje skrobię do różnych cukrów, β-amylaza do glukozy). Do doświadczenia potrzebne będą:
Przygotowanie homogenatu zbożowegoW kuwecie wyłożonej wilgotna lignina wysiewa się 5 g ziaren jęczmienia. Kuwetę przykrywa się folią plastikową i odstawia na 2-3 dni w ciemne miejsce. Bezpośrednio przed doświadczeniem 1 g kiełków uciera się w moździerzu z 5 ml zimnej wody destylowanej. Przygotowanie roztworu skrobi1 g skrobi uciera się w moździerzu z 5 ml zimnej wody na gładką zawiesinę. Zawiesinę tę wlewa się wąskim strumieniem do 500 ml wrzącej wody. Całość gotuje się prez 5 minut, po czym roztwór przelewa się do butelki i oziębia. Przebieg doświadczeniaDo 4 ponumerowanych probówek dodaje się po 1 ml roztworu skrobi i 1 ml roztworu kiełków zbożowych. Do pierwszej probówki dodaje się natychmiast 2 krople roztworu jodu, wstrząsa i notuje zabarwienie jakie powstało. Pozostałe 3 probówki umieszcza się na łaźni wodnej o temperaturze 40°C. Po trzech minutach wyjmuje się probówkę drugą, dodaje do niej 2 krople roztworu jodu, wstrząsa i notuje zabarwienie. Trzecia i czwartą probówkę wyjmuje się odpowiednio po 10 i 15 minutach od włożenia, wykonując za każdym razem próbę z odczynnikiem jodowym. Artykuł napisał
|