Polecamy

sobota, 03 grudnia 2011 21:26

Klasyfikacja zasad uniwersalnych (ogólnych)

Oceń ten artykuł
(0 głosów)

Nim zaczniemy omawiać tzw. "zasady ogólne", zrobimy sobie małe przypomnienie tego, czym są zasady w DNA i jaka jest ich rola w organizmach.
Jak wiemy helikalna struktura DNA jest w zasadzie dwoma skręconymi łańcuchami nukleotydowymi, których skład i budowa jest ściśle określona. DNA składa się z trzech podstawowych elementów:

  • składnika cukrowego
  • reszt fosforanowych
  • nukleozasad

Składnik cukrowy stanowi szkielet całego dna. Elementami tego szkieletu są reszty 2-deoksyrybozy połączone ze sobą w polimer. Szkielet cukrowy znajduje się na zewnątrz helisy DNA i stanowi jego część hydrofilową.


Reszty fosforanowe stanowią rodzaj linkera, czyli elementu łączącego ze sobą reszty cukrowe poprzez wiązanie fosforodiestrowe.

Adenina Guanina

Cytozyna Tymina

Nukleozasady (hydrofobowa wewnętrzna część helisy) stanowią najważniejszą część DNA. W naturalnym DNA znajdujemy 4 różne zasady nukleinowe: tyminę, adeninę, guaninę i cytozynę. Dwie z nich to pochodne puryny - adenina i guanina, dwie to pochodne pirymidyny - tymina i cytozyna (uracyl w RNA).
W helisie DNA składającej się z dwóch łańcuchów polinukleotydowych zasady te ulegają parowaniu. Tworzą tzw. pary komplementarne. Dokładniej mówiąc pomiędzy sąsiadującymi w dwóch łańcuchach nukleozasadami tworzą się wiązania wodorowe utrzymujące strukturę helikalną w całości. Takimi naturalnymi parami komplementarnymi są cytozyna z guaniną i tymina z adeniną.

Adenina - Tymina

Guanina - Cytozyna

Te trzy elementy, czyli: grupa cukrowa, reszta fosforanowa i nukleozasada tworzą tzw. nukleotyd.

Nukleotyd tyminowy
Nukleotyd adeninowy
Nukleotyd guaninowy

Nukleotyd cytozynowy

Jak wiemy DNA przechowuje informację o budowie białek (protein) w naszym organizmie lub innym zawierającym DNA, a zdolnym do syntezy białek. Polinukleotyd DNA składający się poukładanych po sobie nukleotydów koduje nam budowę protein w następujący sposób.
Kolejno ułożone po sobie nukleotydy a właściwie nukleozasady tworzą trójki zwane kodonami. Kodony te informują nas o tym, w jakiej kolejności i jakie aminokwasy będą stanowiły składowe części powstającego (syntezowanego) białka. Ponieważ zasad jest cztery to układy potrójne dają 64 możliwości kodowania aminokwasów, w związku z tym jednemu aminokwasowi przypada więcej niż jedna trójka zasad. Element helisy DNA zawierający dane dotyczące syntezy konkretnego białka nazywany jest genem.

Tutaj zaczyna się historia z badaniami nad sekwencją zasad nukleinowych w DNA i możliwością ich modyfikacji.
Końcem lat 90 ubiegłego wieku rozpoczęto badania nad specyficzną modyfikacją nukleozasad w nukleotydach i ich działaniu w organizmach eukariotów.
Badania te polegały na tym, aby odpowiednio zmodyfikować naturalne nukleozasady lub zastąpić je innymi związkami niekoniecznie mające charakter zasad. Grupy (związki) te nazwano "zasadami ogólnymi - uniwersalnymi- (general bases)".

Nim opowiemy o tym, jakie modyfikacje lub, jakie związki wprowadza się do naturalnego DNA, zastanówmy się, jakie warunki powinna spełniać taka "zasada ogólna".



Po pierwsze powinna się ona parować ze wszystkimi naturalnymi zasadami nukleinowymi. Nie może ona działać wybiórczo tak jak dla przykładu naturalna tymina paruje się tylko i wyłącznie z adeniną, tak zasady ogólne powinny parować się ze wszystkimi czterema naturalnymi nukleozasadami. Powód jest dość prozaiczny. Gdyby dana zasada działała wybiórczo to wprowadzenie jej do DNA mogłoby być wiele trudniejsze, a na dodatek zmniejszałoby to możliwości modyfikowania DNA.



Po drugie ważne jest to by nukleozyd zawierający "zasadę ogólną" mógł być fosforylowany przez kinazy komórkowe. Jeśli nukleozyd taki nie ulegałby fosforylacji nie było by możliwości jego wbudowania w łańcuch polinukleotydowy.



Kolejną ważną rzeczą jest to by taki zmodyfikowany nukleotyd był rozpoznawany przez polimerazy DNA/RNA jako nukleotyd zawierający naturalną nukleozasadę. Konsekwencją tego jest to, że nukleotyd zawierający taką zasadę będzie spożytkowany do budowy nowego DNA/RAN. Zmodyfikowane DNA będzie warunkowało syntezę białek niezgodnie z naturalną sekwencją zapisaną w kodzie genetycznym eukarioty. Będzie wywoływało mutacje.



Czwartą ważną rzeczą jest to, aby DNA zawierające taki zmodyfikowany nukleotyd mogło się dalej klonować oraz by mogło ulegać transkrypcji na łańcuch RNA. Jeśli modyfikowana zasada wywoływałaby efekt zablokowania klonowania łańcucha DNA wprowadzanie takiego nukleotydu nie miałoby sensu gdyż mutacja zakończyłaby się na pojedynczym łańcuchu polinukleotydowym.



Ostatnim kryterium, jakie musi spełniać taka zasada jest kryterium związane z tzw. temperaturą mięknienia. Ważne jest by 2 sparowane, skręcone łańcuchy pilinukleotydowe zawierające modyfikację oraz takie same łańcuchy nie zawierające modyfikacji posiadały zbliżoną temperaturę mięknienia. Temperatura mięknienia jest to temperatura, w której następuje rozplecenia się helikalnej struktury DNA. Różnica pomiędzy temperaturą mięknienia helisy nie zawierającej modyfikacji i temperaturą mięknienia helisy zawierającej takową modyfikację była jak najmniejsza a w praktyce by wynosiła niewiele poniżej zera.

DTm=Tm(nat)- Tm(mod)<0

Jest to ważne z tego względu, że DNA w jądrze komórkowym jest ciągle trawione i odtwarzane. Gdyby takie zmodyfikowane DNA różniłoby się od naturalnego proces ten mógłby zostać zatrzymany a co za tym idzie mogłoby dochodzić do niekorzystnych niechcianych przez nas przemian wewnątrzkomórkowych.
Skoro omówiliśmy sobie już, jakie warunki powinna spełniać taka zasada ogólna powiedzmy teraz o tym, jakie klasy związków i jakie modyfikacje mogą kwalifikować się do "zasad ogólnych".

Proste modyfikacje naturalnych nukleozasad
Wytwarza się takie związki, które będą naturalnymi nukleozasadami, lecz odrobinę zmodyfikowanymi, np. w podstawniki halogenowe i inne typu tlen zastąpiony siarką. Taką znaną i już stosowaną modyfikacją jest guanina, w której zmieniono grupę metylową na atom fluoru a tlen grupy karbonylowej zastąpiono siarką,

Naśladowanie kształtów (budowy) naturalnych nukleozasad
Ma to swoje odbicie w tym, co powiedziane zostało przed chwilą. Syntezuje się takie związki, które będą miały podobny rozkład gęstości elektronowej w swojej cząsteczce. W takim przypadku naturalne zasady będą rozpoznawać modyfikacje jak naturalną zasadę nukleinową, z którą mogą wytworzyć wiązania wodorowe a co za tym idzie mogą utworzyć parę komplementarną,

"Missing bases"
Polega to na wprowadzeniu niekompletnego nukleotydu, czyli takiego, który zawiera grupę cukrową powiązaną wiązaniem fosforodiestrowym ze szkieletem cukrowym, lecz nie zawierającym podstawnika w pozycji 1-b- cukru. Modyfikacja ta jest bardzo wygodna gdyż można zastosować taki nukleotyd jako linker do łączenia łańcuchów polinukleotydowych, lub blokować dalsze klonowanie łańcucha,

Proste węglowodory lub heterocykle
Były pierwszymi stosowanymi (badanymi) zasadami ogólnymi. Do takich modyfikacji może należeć np. benzen czy nitro imidazol. Związki tego typu z reguły destabilizują DNA, gdyż są bardzo nieselektywne, a co za tym idzie wywołują silne mutacje,

Związki fluorescencyjne
Są to zasady bardzo użyteczne z punktu widzenia analizy strukturalnej (sekwencyjnej) DNA. Wprowadzenie takiej zasady pozwala na badanie zmodyfikowanego DNA w świetle UV i innych technikach analitycznych. Najczęściej modyfikowana "zasada ogólna" posiada w swojej cząsteczce układ sprzężonych wiązań, czyli tzw. grupy chromoforowe,

Komplementarne zasady ogólne
Dąży się do tego by wprowadzane zasady ogólne mogły parować się ze sobą nawzajem. Pozwala to na większe możliwości modyfikacyje DNA. Dzięki temu wprowadzone zakłócenie może z równym prawdopodobieństwem znaleźć się w łańcuchu DNA jak i RNA,

"Ligandotydy"
Są to tak modyfikowane nukleotydy, aby w miejscu naturalnej zasady zawierały cząsteczkę mogącą koordynować atomy metali, jak np. żelaza. Pozwala to na tzw. architekturę supramolekularną, czyli na selektywne budowanie łańcuchów polinukleotydowych dzięki odpowiedniej stereoselektywności reakcji prowadzonych przy użyciu związków koordynacyjnych. Przykładem może być tutaj naturalna nukleozasada zastąpiona fenylopuryną (analogia do hemoglobiny),

"Zwiększające siłę wiązań wodorowych"
Są to struktury, które podczas tworzenia komplementarnych par zasad wiążą się z naturalnymi zasadami o wiele silniej niż naturalne nukleozasady między sobą. Zasady tego typu stabilizują helisie DNA. Przykładowo benzen wiąże się silniej od trzech z czterech zasad naturalnych (cytozyny, guaniny i tyminy), a naftalen silniej od wszystkich czterech.


Teraz cos o zastosowaniu praktycznym "zasad ogólnych".

Wbrew temu, co można sądzić, że jest to sztuka dla sztuki tak nie jest. Obecnie prowadzi się badania nad zastosowaniem takich modyfikowanych nukleotydów różnego typu terapii, a w szczególności antywirusowej.
Dzięki wprowadzeniu takiej "zasady ogólnej" do DNA w jądrze komórkowym eukarioty możemy wywołać korzystne zmiany mutagenne. Chodzi głównie o to by dane DNA zostało bądź to zablokowane, tzn., aby jego klonowanie nie następowało, lub też by wywoływało (kodowało) nienaturalne białko. Podobnie jest w przypadku wprowadzenia takiej modyfikacji w DNA wirusa. Dzięki temu możemy zablokować jego działanie. Tutaj mamy dwoistą metodykę. Pierwsza opiera się na takim zmutowaniu DNA wirusa, aby nie było możliwości jego klonowania na DNA ludzkie (zwierzęce). Druga to taka, aby dzięki zmianie sekwencji DNA wywołać zakłócenie w syntezie białek.
Dla przykładu. Kapsuła wirusa HIV pokryta jest białkiem (glokoproteina 120), które umożliwia usadowienie się na komórkach leukocytów. Jeśli wprowadzilibyśmy takie zakłócenie, aby DNA wirusa nie potrafiło syntezować takiego białka lub produkowałaby białko o innej strukturze nie mającej powinowactwa do komórek leukocytów, to wirus ten nie mógłby się rozpowszechniać w organizmie, a co za tym idzie obumierałby razem z zainfekowaną komórką.
Poniższy model przedstawai transkrypcję zmutowanego DNA na łańcuch RNA.


Póki, co badania tego typu prowadzone są na poziomie komórkowym i nikt jeszcze nie otrzymał gotowych uniwersalnych "zasad ogólnych" spełniających te wszystkie kryteria i działające w taki właśnie pożądany sposób, lecz badania wciąż trwają i są rozwijane, więc wiele jeszcze przed nami.
Artykuł napisał:
Tchemik
LITERATURA:
[1] Waldemar Lewiński; "Molekularne podstawy biologii"; Wydanie II; OPERON 1999
[2] Paul Berg, Maxine Singer; Język genów - Poznawanie zasad dziedziczenia; Wydanie I; Prószyńskie i S-ka 1997
[3] Eric T. Cool; "Replacing the nucleobases in DNA with desinger molecules"; Acc. Chem. Res.; 35; 2002
[4] David Loackes; "The applications of universal DNA base analogues"; Nucleic Acids Research; 29; 2001
[5] Ingrid Luyten, Piet Herdewijn; "Hybridization properties of base-modyfied oligonucleotides within the double and triple helix motif"; Eur. J. Med. Chem.; 33; 1998
[6] Krzysztof Walczak, Michael Wamberg, Erik B. Pedersen; "Synthesis of Acyclic Nitroazole Nucleosides and their Incorporation into Oligonucleotides. Their Duplex and Triplex Formation"; (jeszcze niopublikowane)
Czytany 7200 razy Ostatnio zmieniany środa, 07 grudnia 2011 20:16
Zaloguj się, by skomentować