Spis treści

1. Spis treści
2. Wstęp
3. Działanie interkalatorów, zjawisko interkalacji, di- i triinterkalacji
4. Podział interkalatorów
4.1. Podział interkalatorów ze względu na budowę układu podstawowego
4.1.1. Interkalatory naftalimidowe
4.1.2. Interkalatory pirokarbazolowe
4.1.3. Interkalatory antracyklinowe
4.1.4. Interkalatory akrydynowe
4.1.5. Interkalatory chinazolinowe
4.1.6. Interkalatory metaloorganiczne
4.1.7. Interkalatory typu „general bases”
4.1.8. Interkalatory „nawlekające”
4.1.9. Inne nieklasyczne interkalatory
4.2. Podział interkalatorów ze względy na posiadany ładunek
4.2.1. Interkalatory naładowane
4.2.2. Interkalatory nie naładowane
5. Interkalatory naftalimidowe
5.1. Syntezy interkalatorów naftalmidowych
5.2. Przykłady syntez łańcuchów alifatycznych stosowanych w interkalatorach naftalimidowych
6. Podstawowe informacje na temat właściwości fluorescencyjnych interkalatorów naftalimidowych
7. Literatura

2. Wstęp

Interkalatory są jedną z najważniejszych grup związków, które oddziaływują z podwójną helisą DNA. Niektóre z nich są już stosowane w leczeniu chorób nowotworowych takich jak rak piersi czy białaczka. Wiele związków jest badanych pod kątem aktywności biologicznej, interkalacji, działania antynowotworowego i antywirusowego.
Interkalatory charakteryzują się płaską budową, dzięki czemu mogą łatwo wbudowywać się pomiędzy pary nukleozasad. Są to najczęściej płaskie układy kilku skondensowanych pierścieni aromatycznych i/lub heteroaromatycznych. Często w budowie interkalatorów znajdujemy funkcjonalizowane łańcuchy alifatyczne, mające ważną role w procesie wiązania z helisą DNA.
Początków badań nad interkalatorami można szukać w latach sześćdziesiątych ubiegłego stulecia, kiedy to naukowcy zauważyli pewne interakcje pomiędzy niektórymi układami heteroaromatycznymi z helikalną strukturą DNA. Jednym z pierwszych stosowanych interkalatorów był bromek etydyny, o którym wspomnę jeszcze w dalszej części pracy.

3. Działanie interkalatorów, zjawisko interkalacji, di- i triinterkalacji

Interkalatory różnego typu mają zasadniczo za zadanie wbudować się w helikalną strukturę DNA tak by zająć miejsce pomiędzy komplementarnymi parami nukleozasad tworząc trwały kompleks z tą strukturą. [1]

Rys.1. Proces wbudowywania się interkalatora w DNA

Na powyższym schematycznym rysunku możemy zaobserwować jak płaski interkalator wbudowuje się pomiędzy sąsiadujące pary nukleozasad.
Wprowadzenie interkalatora do helikalnej struktury DNA wywołuje różnego typu zmiany topologiczne. Począwszy od rozsunięcia planarnie ułożonych nukleozasad, przez częściowe rozluźnienie i rozkręcenie helisy, aż po zmianę wymiarów bruzd pomiędzy dwoma skręconymi oligonukleotydami.
Oddziaływanie interkalatorów z DNA ma skomplikowany charakter. Interkalatory oddziaływują z DNA na kilka możliwych sposobów. Pierwszą możliwością jest tworzenie wiązań wodorowych na podobnych zasadach jak to się dzieje w przypadku naturalnego parowania nukleozasad oraz oddziaływań pomiędzy funkcjonalizowanymi łańcuchami alifatycznymi (zawierającymi m.in. grupy –OH), a nukleozasadami czy szkieletem cukrowym. Kolejny typ oddziaływania pomiędzy interkalatorami a DNA to tworzenie tzw. p-kompleksów. Dzięki temu, że interkalatory to skondensowane układy aromatyczne, są w stanie oddziaływać przez nakładanie orbitali HOMO i LUMO z nukleozasadami znajdującymi się w DNA.
Kolejnymi oddziaływaniami pomiędzy interkalatorami a DNA jest oddziaływanie typu sił Van der Wallsa oraz przyciąganie elektrostatyczne (Culombowskie), co ma swoją szczególną rolę w przypadku interkalatorów mających budowę jonową tzn. zawierające w swojej cząsteczce atom niosący ładunek elektryczny. Najrzadziej interkalatory wiążą się z DNA za pomocą wiązań kowalencyjnych.
Zjawisko interkalacji nie musi być zjawiskiem pojedynczego wbudowania w DNA. W zależności od budowy interkalatora może on oddziaływać w kilku miejscach naraz. Interkalator zbudowany z kilku płaskich układów cyklicznych połączonych ze sobą łańcuchami alifatycznymi, może kilkakrotnie wbudowywać się w strukturę DNA, wg poniższego schematu.

Rys.2. Schematyczne przedstawienie zjawiska di- i triinterkalacji

Interkalatory o takiej budowie i działaniu nazywane są poliinterkalatorami. Łańcuchy, które łączą ze sobą układy aromatyczne mają za zadanie nie tylko łączyć je ze sobą, lecz także wiązać się z DNA przez tworzenie wiązań wodorowych bądź to z nukleozasadami, bądź to z cukrowym szkieletem DNA.
Działanie, interkalatorów można podzielić na dwa główne typy:

blokowanie klonowania DNA

wywoływanie mutacji DNA
Blokowanie klonowania DNA odbywa się poprzez oddziaływanie interkalatora z DNA poprzez ustabilizowanie bądź destabilizację helikalnej struktury DNA, oraz przez tworzenie kompleksów z enzymami odpowiedzialnymi za klonowanie DNA.
Interkalator owijając się wokół helisy DNA może zablokować możliwość jej rozplecenia, a co za tym idzie, niemożliwe jest wytworzenie widełek replikacyjnych i klonowanie DNA.
Interkalatory mają możliwość tworzenia kompleksów z enzymami białkowymi odpowiedzialnymi za klonowanie DNA. Enzymami tymi są polimerazy DNA, i topoizomerazy, których zadaniem jest wytworzenie kompleksu z DNA i jego rozplecenie (zmiana topologii) w celu dalszego klonowania.
Interkalator tworząc kompleks z topoizomerazą II, stabilizuje helisę DNA i uniemożliwia jej rozplecenie. W ten sposób blokowana jest możliwość klonowania DNA, podział komórki i jej dalszy rozwój.
Gdy interkalator nie tworzy na tyle trwałej struktury z DNA lub jego enzymami by zapobiec jego klonowaniu może wywoływać kontrolowane mutacje tegoż DNA.
Interkalatory tego typu mają za zadanie wywołanie mutacji w DNA poprzez zmianę przestrzennej struktury DNA w procesie klonowania lub zakłócenie parowania się zasad nukleinowych. Zarówno proces klonowania jak i wywoływanie mutacji ma na celu zablokowanie, lub unieszkodliwienie komórek rakowych lub wirusów, przed ich dalszą ekspansją w organizmie. Zmiany te wpływają bezpośrednio na syntezę białek komórkowych lub wiralnych, a co za tym idzie doprowadza do ich zablokowania lub śmierci.
Kolejną cechą interkalatorów jest to, iż układ sprzężony w pierścieniach aromatycznych lub heteroaromatycznych jest typową grupą chromoforową, co pozawala na badanie helikalnej struktury DNA metodami spektroskopowymi w świetle widzialnym i ultrafioletowym, przez co związki te nazywamy znacznikami (markerami) genetycznymi.
Interkalatory typu zasad generalnych, które wbudowują się w DNA w miejsce nukleotydu zawierającego naturalną nukleozasadę, pozwalają na badanie właściwości DNA w procesach komórkowych. Badaniom w UV można poddawać komplementarne oligonukleotydy zawierające interkalator i badać ich zachowanie pod wpływem nukleaz, odpowiedzialnych za przebudowę („cięcie”) łańcucha DNA. Możemy dzięki temu stwierdzić czy wprowadzony interkalator nie wywołuje rozpadu helisy, lub czy nie blokuje klonowania DNA pod wpływem polimeraz.
Projektuje się je zarówno jako typowe nukleozydy zawierające 2-deoksy-D-rybozę, jak i nukleozydy acykliczne posiadające w miejsce sacharydu, alifatyczny łańcuch polihydroksylowy, o odpowiedniej budowie przestrzennej grup hydroksylowych. [2]

a)b)

Rys.3. Przykład interkalatora nukleozydowego a) klasycznego b) acyklicznego

4. Podział interkalatorów

Znane do tej pory interkalatory możemy podzielić według dwóch podstawowych kategorii. Jedna z nich uwzględnia budowę układu aromatycznego lub heteroaromatycznego, który stanowi trzon interkalatora, druga uwzględnia budowę pod względem posiadanego ładunku elektrycznego.

4.1. Podział interkalatorów ze względu na budowę układu podstawowego

Układ aromatyczny (heteroartomatyczny) będący podstawowym układem w strukturze interkalatora może mieć różnoraki kształt oraz może być w różny sposób funkcjonalizowany. [1, 2, 3, 4]
Spośród obecnie stosowanych lub badanych interkalatorów możemy wyróżnić:

• interkalatory naftalimidowe
• interkalatory pirokarbazolowe
• interkalatory antracyklinowe
• interkalatory akrydynowe
• interkalatory chinazolinowe
• interkalatory porfirynowe
• interkalatory metaloorganiczne
• interkalatory typu „general bases”
• inne nieklasyczne interkalatory
  
  

4.1.1. Interkalatory naftalimidowe

W latach siedemdziesiątych ubiegłego stulecia zespół M. F. Brana rozpoczął prace nad interkalatorami naftalimidowymi. [1, 3, 7] Modyfikacje układu naftalimidowego odbywały się zarówno w łańcuchu alifatycznym przy imidowym atomie azotu, jak i w pierścieniu aromatycznym.
Jednym z pierwszych badanych interkalatorów był 3-nitro(amino)-(N-2-aminoetylo)-1,8-naftalimid oraz jego modyfikacje w grupie aminowej i pierścieniu aromatycznym.

b)

Rys.4. Mitonafid oraz amonafid

Grupy R i R’ były najczęściej grupami metylowymi. Przedstawione na rysunku struktury nazwane kolejno mitonafid i amonafid wykazuje działanie interkalatywne, oraz cytotoksyczność w odniesieniu do komórek HeLa (komórki nabłonkowe raka szyjki macicy).
Kolejne modyfikacje obejmowały miejsce podstawienia w pierścieniu naftalenowym. Modyfikacje głównie opierały się na wprowadzeniu w pozycji 7 pierścienia grypy nitrowej, aminowej lub alkilo- i dialkiloaminowej.
Modyfikacje te nie wniosły wielkiej zmiany w aktywności biologicznej, zarówno w oddziaływaniu na komórki rakowe jak i stabilność kompleksów z topoizomerazą II.
W toku badań nad interkalatorami naftalimidowymi syntezowano także i badano diinterkalatory naftalimidowe, m.in. takie jak na poniższym rysunku i jego modyfikacje.

Rys.5. Diinterkalator naftalimidowy

4.1.2. Interkalatory pirokarbazolowe

Elliptycyna (5,11-dimethylpyrydo[3,4-b]karbazol) i jej pochodna 9-metoksyelliptycyna (9-metoksy-5,11-dimethylpyrydo[3,4-b]karbazol) są naturalnymi alkaloidami wyizolowanymi z liści Ochrosia elliptica. [1]

Rys.6. Elliptycyna oraz 9-metoksyelliptycyna

Alkaloidy te same w sobie wykazują szerokie spektrum aktywności antynowotworowej. Badania nad interkalatorami pirokarbazolowymi oparły się na wpływie modyfikacji podstawników pierścienia pirokarbazolowego.
W toku badań zaobserwowano, że usunięcie grupy metylowej z pozycji 5 oraz podstawienie atomów azotu w pierścieniu karbazolowym innymi heteroatomami, takimi jak siarka czy tlen, kończyły się całkowitą utratą aktywności biologicznej.
Modyfikacje atomu azotu w pierścieniu pirydynowym nie wykazały wzrostu aktywności lub jej obniżenia, w przypadku zastąpienia pierścienia pirydynowego, benzenowym. Kolejne modyfikacje miały doprowadzić do syntez diintekalatorów pirokarbazolowych. Przedstawiona poniżej pochodna elliptycyny, wykazywała diinterkalację, silne oddziaływanie z parami nukleozasad guanina-cytozyna oraz topoizomerazą II, lecz podczas badań klinicznych wykazała wysoką hepatotoksyczność i jej stosowanie zostało wstrzymane.

Rys.7. Diterkalina

4.1.3.Interkalatory antracyklinowe

Leki antracyklinowe wykorzystywane w walce z rakiem zostały odkryte na początku lat sześćdziesiątych i obecnie jeden z nich – doksorubicyna – jest najczęściej stosowanym lekiem przeciwnowotworowym. Wykazuje ona bardzo silne oddziaływanie z topoizomerazą II, jednak ze względu na poważne skutki uboczne tego związku (min. Osłabienie mięśnia sercowego – kardiotoksyczność) poszukiwano mniej szkodliwych odpowiedników. [1]

Rys.8. Doksorubicyna

Wieloletnie badania nad pochodnymi antracyklinowymi opierające się na modyfikacjach pierścienia antrachinonowego lub jego podstawników nie doprowadziły do przełomowych odkryć. Jedynym mniej toksycznym lekiem od doksorubicyny okazały się analogi antracyklinowe przedstawione na rys.9, którymi są mitoksantron i ametantron.

Rys.9. X=OH – mitoksantron, X=H – ametantron

W toku badań opracowano także syntetyczne pochodne doksorubicyny o budowie diinterkalatora. Niektóre z otrzymanych pochodnych wykazywały bardzo silne współdziałanie z topoizomerazą II, lecz toksycznością nie ustępowały w znacznym stopniu doksorubicynie i jej analogom, a co za tym idzie ich stosowanie było ograniczone.

4.1.4. Interkalatory akrydynowe

W ciągu kilkunastu ostatnich lat, prowadzi się badania nad interklatywnym i antynowotworowym działaniem akrydyny i jej pochodnych. Dzięki temu, że pierścień akrydynowy ma strukturę planarną, można było ją podejrzewać o zdolność do wtrącenia pomiędzy pary nukleozasad i silne interakcje z DNA. [1]

Rys.10 Akrydyna

Badania nad pochodnymi akrydyny, doprowadziły do syntezy związków, które okazały się być bardzo silnymi inhibitorami topoizomerazy II. Wśród wielu badanych pochodnych na czoło wysuwają się: amaskaryna,

Rys.11 Amaskaryna

oraz tzw. DACA (N-(2-(dimetyloamino)etylo)akrydyno-4-karboksylamid) i jej 9-aminopochodna.

Rys.12 R=H – DACA, R=NH2 – 9-amino DACA

Jednym z obecnie stosowanych preparatów będących analogami akrydyny jest aktynomycyna D.

Rys.13 Aktynomycyna

Aktynomycyna D jest cytostatykiem, który stosuje się w leczeniu niektórych nowotworów, m. in. narządów rodnych.
Wadą aktynomycyny D jest to, iż może ona wywołać uszkodzenie płodu, gdy stosowana jest w okresie ciąży. Aktynomycyna D tworzy silny kompleks z topoizomerazą II, co zapewne w znacznym stopniu zwiększa jej cytotoksyczność.

4.1.5. Interkalatory chinazolinowe

Benzimidazolo[1,2-c]chinazoliny są nową klasą związków mających zdolność do wnikania w helikalną strukturę DNA. [1] Główna struktura wzorowana była na znanym interkalatorze, którym jest bromek etydyny.

Rys.14 Bromek etydyny

Największą aktywność biologiczną w odniesieniu do białaczek i komórek mięśniaka ludzkiego, wykazały pochodne chinazoliny przedstawione na rys.15.

Rys.15 Pochodne benzimidazolo[1,2-c]chinazoliny wykazujące właściwości interkalatywne

Seria badań doprowadziła do syntezy takich pochodnych, w których dwa pierścienie benzimidazolo[1,2-c]chinazoliny połączone zostały łańcuchem poliaminowym.

Rys.16 Diinterkalator 1,3-benzodiazynowy (chinazolinowy)

Najsilniejsze oddziaływanie z DNA i topoizomerazą II wykazała pochodna, gdzie grupa Z miała postać: -(CH2)3-N(CH3)-(CH2)3-.

4.1.6. Interkalatory metaloorganiczne

Spośród interkalatorów metaloorganicznych można wyróżnić dwie główne grupy – porfirynowe i inne. [4, 5]
Prace nad interkalatorami metaloorganicznymi rozpoczęły się w latach dziewięćdziesiątych ubiegłego stulecia, pod kątem ich właściwości w profilaktyce nowotworowej i HIV.

Rys.17 Podstawiony pierścień metaloporfirynowy

Grupami R, były różnego typu funkcjonalizowane pierścienie aromatyczne i heteroaromatyczne takie jak naftalenowy czy pirydynowy. Wprowadzenie interkalatora zawierającego metal ciężki taki jak, miedź, rod, ruten i inne miało na celu uczulenie zmutowanych (zrakowaciałych, zawirusowanych) komórek na działanie czynnika, radioterapeutycznego.
Wprowadzenie takiego czynnika miało w trakcie naświetlania wywoływać uszkodzenie nukleotydu, na tyle by nie wywoływało ubocznych skutków u osoby leczonej, ale na tyle skuteczne by enzymy komórkowe nie były w stanie odbudować zniszczonego elementu.
W niektórych przypadkach kompleks metalu koordynuje się z inny interkalatorem by będąc w sąsiedztwie DNA wywoływać wyżej omówione skutki.

Rys.18 Interkalator z podwieszonym kompleksem metalu z ter-pirydyną

Prace nad interkalatorami metaloorganicznymi wciąż trwają.

4.1.7. Interkalatory typu „general bases”

Terminem „general bases” (zasad generalnych) określa się związki, które można wbudować w oligonukleotyd w miejsce naturalnej nukleozasady. [7]
Taka zasada musi spełniać pięć podstawowych kryteriów:

• musi się parować ze wszystkimi naturalnymi nukleozasadami
• nukleozyd zawierający „zasadę generalną” musi być fosforylowany, przez kinazy komórkowe
• nukleotyd zawierający „general bases” musi być rozpoznawany przez enzymy komórkowe i wbudowywany w oligonukleotyd
• modyfikacja nie może blokować klonowania DNA
• nie powinna powodować obniżenia trwałości helisy DNA

„General bases” tego typu można uznać za interkalator tylko wtedy, gdy oddziaływania pomiędzy „zasadą generalną”, a helisą DNA nie polegają tylko na tworzeniu wiązań wodorowych, lecz jest to głównie oddziaływanie typu: tworzenie ?-kompleksów, oddziaływanie elektrostatyczne, etc.
Obecnie w fazie badań znajduje się kilka typów „modyfikacji” nukleozasad. Można wymienić tutaj takie modyfikacje, jak: fluorouracyl, naftalen, czy 2,5-di(tiofen-2-yl)tiofen.

Rys.19 Przykładowe „general bases” (X – część cukrowa)

Modyfikacje tego typu są jedynymi interkalatorami które wiążą się z DNA wiązaniami kowalencyjnymi, w strukturę szkieletu cukrowego.
Wprowadzenie „generalnej zasady” ma głównie na celu zaburzenie transkrypcji DNA na mRNA, a co za tym idzie syntezy białek na rybosomach.

4.1.8. Interkalatory „nawlekające”

Interkalatorów „nawlekających” (threading intercalators) nie można zakwalifikować do konkretnego typu pod względem układu macierzystego. [1, 4] Związki tego typu mają budowę typu: łańcuch–układ płaski–łańcuch.
Podczas badań stwierdzono, że interkalatory tego typu łączą się z helisą DNA w pewien konkretny sposób. Płaski układ aromatyczny (heteroartomatyczny) wtrąca się pomiędzy pary nukleozasad a dwa boczne łańcuchy oplatają DNA, z czego jeden z nich „wciska się” w szerszą, a drugi w węższą bruzdę, podwójnej spirali DNA. Interkalatory tego typu są związkami, które bardzo mocno wiążą się z DNA, a co za tym idzie silnie inhibitują działanie topoizomerazy II, nie pozwalając na rozplecenie helikalnej struktury DNA.

Rys.20 Przykłady interkalatorów „nawlekających” naftaldiimidowych i antrachinonowych

Badania nad kinetyką dysocjacji (rozplatania) DNA blokowanego przez interkalator „nawlekający” dowiodły, że czas rozplatania jest funkcją długości łańcucha podczepionego do układu podstawowego.
Zarówno układ naftaldiimidowy jak i antrachinonowy zastosowany w interkalatorach „nawlekających” wykazał bardzo dobre właściwości interkalacyjne. Modyfikacje układu podstawowego nie wniosły wielkiej zmiany w kinetyce dysocjacji sparowanego oligonukleotydu.

4.1.9. Inne nieklasyczne interkalatory

Nieklasyczne interkalatory, podobnie jak wcześniej wymienione interkalatory „nawlekające” są grupą związków, których nie można jednoznacznie przypisać do którejkolwiek z wcześniej wymienionych klas układów podstawowych. [1, 4]
Interkalatory nieklasyczne to takie związki, które wykazują właściwości interkalatywne spełniając warunek – płaska cząsteczka z funkcjonalizowanymi łańcuchami.
Wśród tzw. nieklasycznych interkalatorów znajdujemy pochodne różnego typu układów aromatycznych i heteroaromatycznych takich jak: karbolina, fenazyna, antracen, etc.

Rys.21 Przykład interkalatora nieklasycznego

Badane związki dobiera się tak by były w stanie utworzyć trwały kompleks z topoizomerazami, a co za tym idzie, by miały silne działanie interkalatywne. Spośród wielu syntezowanych związków, nieliczne tylko okazują się być na tyle mało cytotoksyczne by można je było stosować jako interkalatory lub leki antynowotworowe czy antywirusowe.

4.2. Podział interkalatorów ze względy na posiadany ładunek

Interkalatory są cząsteczkami złożonymi, zawierającymi w swojej cząsteczce różnego typu układy cykliczne i acykliczne. Niektóre z nich posiadają atomy lub grypy atomów obdarzonych ładunkiem elektrycznym. Dzięki temu interkalatory możemy podzielić także na:

• interkalatory naładowane
• erkalatory nie naładowane

4.2.1. Interkalatory naładowane

Wśród interkalatorów, które w swojej cząsteczce posiadają atom obdarzony ładunkiem elektrycznym, możemy wyróżnić dwa typy:

• zawierające naładowany atom (atomy) w układzie podstawowym
• zawierające naładowany atom (atomy) w układzie bocznym (najczęściej fragmencie acyklicznym)

Jednym z najbardziej znanych interkalatorów zawierających atom naładowany w układzie podstawowym jest wcześniej wspominany bromek etydyny (Rys.14) i pochodne imidazolodichinoliny

Rys.22 Kation imidazolodichinolinowy

Wśród interkalatorów zawierających naładowany atom w łańcuchu bocznym znajdujemy wiele pochodnych czy to naftalimidu czy akrydyny.

Rys.23 Naładowany interkalator naftalimidowy

Interkalatory naładowane łączą się z DNA nie tylko wiązaniami wodorowymi, lecz także poprzez oddziaływania elektrostatyczne z nukleozasadami.
Jak wiadomo tymina czy cytozyna, posiada w swojej strukturze grupę karbonylową, dość silnie spolaryzowaną.

Rys.24 Polaryzacja cząsteczki tyminy

Wprowadzenie interkalatora naładowanego będzie warunkowało jego wbudowanie się pomiędzy pary zasad gdzie nastąpiła polaryzacja grup karbonylowych, przez co interkalator silniej wiąże się z DNA tworząc kompleks jonowy.

4.2.2. Interkalatory nie naładowane

Interkalatory nie naładowane są mniej wybiórcze w tworzeniu kompleksów z DNA niż ich naładowane odpowiedniki. Wiążą się z DNA poprzez wiązania wodorowe czy też tworzenie p-kompleksów. Wyjątkiem może być interkalator zawierający grupy mogące występować w granicznej strukturze jonowej lub z silnie polarnymi łańcuchami bocznymi.
Interkalator tego typu może oprócz typowych oddziaływań z DNA, wiązać się z nim na zasadzie tworzenia kompleksu jonowego.

5. Interkalatory naftalimidowe

Wiele z badanych przez zespoły Brana oraz Capranico, pochodnych naftalimidu wykazało aktywność biologiczną. Część z nich wykazywało negatywne skutki w postaci wysokiej cytotoksyczności, część wykazywała działanie antynowotworowe. [1]
Jak wspomniano wcześniej ważną cechą było także wprowadzenie modyfikacji w pierścieniu naftalenowym układu podstawowego interkalatora. Zauważono, że wysoką cytotoksycznością cechowały się te interkalatory, które posiadały w bocznym łańcuchu alifatycznym niezabezpieczoną (nie podstawioną) grupę aminową. Zespół M.F. Brana zsyntezował wiele połączeń tego typu i określił ich właściwości biologiczne.
W trakcie badań wykazano, że większą aktywność biologiczną wykazują pochodne, w których grypa aminowa jest oddalona od azotu imidowego o przynajmniej dwie grupy metylenowe. [3]
W poniższej tabeli przedstawiono wartości współczynników IC₅₀ i LD₅₀ dla pochodnych 3-nitronafatalimidu, gdzie kolejnymi podstawnikami azotu imidowego były:
1) –CH2–CH2–N(Me)2
2) –CH2–CH2–N(Et)2
3) –CH2–CH2–(N-pirolidyna)
4) –CH2–CH2–(N-piperydyna)

Tab.1. Toksyczność niektórych interkalatorów naftalimidowych [3]

Podstawnik	IC50 [mg/ml] komórki HeLa	IC50 [mg/ml] komórki KB	LD50 [mg/kg] mysz	LD50 [mg/kg] szczur
1	0,15	0,20	10,0	6,5
2	2,5	3,5	13,0	32,5
3	0,3	0,35	12,6	4,5
4	2,0	2,0	40,0	9,1

Badaniom także poddane były modyfikacje naftalimidowych interkalatorów, w których pierścień naftalenowy zastępowano fenentrenem lub jego heterocyklicznymi odpowiednikami jak benzo[h]chinoliną.
One także wykazywały aktywność biologiczną w odniesieniu do komórek Hela i innych komórek rakowych.
Dość wysoką skutecznością w blokowaniu komórek rakowych wykazują także interkalatory binaftalimidowe oraz diinterkalatory naftalimidowe.
Diinterkalatory naftalimidowe utworzone wg schematu umieszczonego poniżej, wykazywały niejednokrotnie o wiele wyższy współczynnik IC₅₀ od wspominanych na początku mitonafidu oraz amonafidu.

Rys.25 Schemat budowy diinterkalatora naftalimidowego

Grupami Z były zarówno łańcuchy alifatyczne zawierające w swojej strukturze grupy aminowe jak i pierścienie heterocykloalkanowe typu piperazyny.
Dobre wyniki uzyskano także w wyniku syntezy i badania właściwości interkalatorów binaftalimidowych.

Rys.26 Przykład budowy interkalatora binaftalimidowego

5.1. Syntezy interkalatorów naftalimidowych

Syntezę interkalatora naftalimidowego, można podzielić na trzy podstawowe etapy:

• syntezę części naftalenowej
• syntezę łańcucha alifatycznego
• sprzęganie łańcucha alifatycznego z częścią naftalenową

Synteza łańcuchów alifatycznych zostanie omówiona osobno w punkcie 5.2.
Synteza częsci naftalenowej opiera się zasadniczo na syntezie odpowiednio podstawionego bezwodnika kwasu 1,8-naftalenodikarboksylowego. [3]
Jedyną opłacalną metodą otrzymywania bezwodnika kwasu 1,8-naftaleno-dikarboksylowego jest synteza z acenaftenu. Zespół M.F. Brana syntezował bezwodnik i jego 4-podstawione pochodne, według następującego schematu.

a= HClSO₃, b= Na₂Cr₂O₇/H⁺, c= KOH, d= HNO₃/AcOH, e= H₂/Pd
Rys.27 Schemat syntezy 4-pochodnych bezwodnika kwasu 1,8-naftalenodikarboksylowego

Syntezy 3-pochodnych bezwodnika były realizowane z użyciem komercyjnego bezwodnika kwasu 3-nitro-1,8-naftalenodikarboksylowego wg poniższego schematu.

a= H₂/Pd, b= PCl₅, c= HNO₂/H⁺/D, d=(CH₃)₂SO₄, e= C₂H₅COCl, f= Ac₂O
Rys.28 Schemat syntezy 3-pochodnych bezwodnika kwasu 1,8-naftalenodikarboksylowego

Pozostałe modyfikacje można przeprowadzać za pomocą kolejnych syntez wykorzystując wpływ podstawników na kolejne podstawienie w pierścieniu aromatycznym.
Kondensacja części naftalenowej z łańcuchem alifatycznym sprowadza się do jednej syntezy. Łańcuch alifatyczny, który ma być połączony z bezwodnikiem musi zawierać terminalną nie podstawioną grupę aminową.
Reakcja przebiega wtedy wg schematu:

Rys.29 Sprzęganie części naftalenowej z łańcuchem alifatycznym

5.2. Przykłady syntez łańcuchów alifatycznych stosowanych w interkalatorach naftalimidowych

Pod pojęciem łańcuchów alifatycznych stosowanych w interkalatorach rozumiemy wszelkiego rodzaje alkilo-, cykloalkano-, arylo- i heteroarylomodyfikacje stosowane w budowie interkalatorów DNA.
Do najczęściej stosowanych „spacer’ów” należą te, w których znajdujemy grupy:

• hydroksylowe,
• aminowe,
• części cukrowe lub pochodne.

Jak wiadomo, bardzo często ważna jest budowa przestrzenna elementów strukturalnych związku biologicznie aktywnego. Nie raz okazuje się, że jeden ze stereoizomerów wykazuje znaczną aktywność biologiczną, a drugi jest jej całkowicie pozbawiony. Związane jest to z budową przestrzenną bądź to receptora, bądź jakiejkolwiek struktury, z która wiąże się lek.
W interkalatorach, a mówiąc dokładniej w ich łańcuchach bocznych także mogą znajdować się elementy chiralne o konkretnej geometrii przestrzennej. Przykładem łańcucha stosowanego w interkalatorach może być łańcuch zawierający na dwóch ostatnich atomach węgla grupy hydroksylowe. Konfiguracja chiralnego (przedostatniego) atomu węgla odgrywa kluczową rolę w działaniu tego typu interkalatora.
Jedna z możliwych dróg syntezy części alkilowej przedstawiono poniżej.
Synteza tego łańcucha rozpoczyna się od D-mannitolu, czyli (2R,3R,4R,5R)-heksahydroksyheksanu, a którego otrzymuje się 2,2-dimetylo-(R)-4-hydroksymetylo-1,3-dioksolan, tzw. solketal.

Pierwszym etapem syntezy jest acetalizacja D-mannitolu do 1,2:5,6-di-O-izopropylideno-D-mannitolu acetonem, w obecności bezwodnego chlorku cynku z wydajnością 55%. [7]

Następnym etapem syntezy solketalu jest degradacja zabezpieczonego D-mannitolu.
W literaturze spotyka się metodę, gdzie wiązanie 3-4 jest utleniane za pomocą wodnego roztworu jodanu(VII) sodu do 2,2-dimetylo-1,3-dioksolanoformaldehydu. [9]

2,2-dimetylo-1,3-dioksolanoformaldehyd jest nie tylko substratem do otrzymywania wcześniej już wspomnianego solketalu, lecz do wielu innych pochodnych mających swoje zastosowanie w syntezie interkalatorów.

Solketal można otrzymywać z 2,2-dimetylo-1,3-dioksolanoformaldehydu in situ bez konieczności wydzielania go z mieszaniny poreakcyjnej redukując wodorem na katalizatorze palladowym. [10]

Wspomniany wcześniej 2,2-dimetylo-1,3-dioksolanoformaldehyd dzięki grupie karbonylowej ulega reakcjom addycji. W reakcji „Wittiga” z cyjanometylofosforanem dietylu w obecności węglanu potasu, otrzymano nienasycony nitryl. [9]

Otrzymano izomery E i Z w proporcji E:Z – 3:1 z wydajnością 98%.

Tak otrzymany nitryl redukuje się do aminy, a otrzymany produkt gotowy jest do połączenia z częścią podstawową interkalatora lub poddania innym modyfikacjom w celu wydłużenia łańcucha lub jego funkcjonalizowaniu.

Oczywiście łańcuch można przedłużać inną drogą. Jedną z metod jest O-podstawienie 2,2-dimetylo-4-hydroksymetylo-1,3-dioksolanu. Można to realizowć kilkoma sposobami, z czego jeden to O-tosylowanie.
Reakcje solketalu z chlorkiem tosylu przeprowadza się w środowisku pirydyny.

Tak otrzymana pochodną tosylanową poddajemy reakcji z N-(hydroksy-alkilo)ftalimidem w bezwodnym DMF w obecności stechiometrycznej ilości wodorku sodu.

Dla różnych n otrzymamy różne wydłużenie łańcucha.
Oczywiście N-alkiloftalimid nie musi koniecznie zawierać prostego łańcucha alkilowego. Może być to łańcuch funkcjonalizowany grupami aminowymi, pierścieniami cyklicznymi i heterocyklicznymi, lecz trzeba pamiętać by podczas syntezy odpowiednio je zabezpieczyć.
Następnie w reakcji z hydrazyną rozszczepiamy zabezpieczenie ftalimidowe otrzymując terminalną grupę aminową.

Po spięciu gotowego łańcucha z układem macierzystym interkalatora acetal rozszczepia się za pomocą wodnego 80% r-ru kwasu octowego. [11]

Kolejną grupą łańcuchów są pochodne zawierające w swojej strukturze grupy aminowe. Mają one podobne zastosowanie, mogą być różnie wykorzystane w syntezie łańcuchów z przeznaczeniem do budowy diinterkalatorów.
Syntezę rozpoczyna się od alkanu zawierającego dwie terminalne grupy aminowe, który kondensuje się z N-zabezpieczoną glicyną. W syntezie użyto glicynę zabezpieczoną grupami t-butoksykarbonylowymi (Boc) w chlorku metylenu. [3]

Zabezpieczenie t-butoksykarbonylowe rozszczepiono przy użyciu metanolowego roztworu gazowego chlorowodoru. [3]

W ostatnim etapie redukuje się zawarte w cząsteczce grupy karbonylowe za pomocą borowodoru w bezwodnym THF. [3]

Jeśli w syntezie użyjemy reagenta posiadającego centrum asymetrii, otrzymamy łańcuch o konkretnej topologii.
Gdyby we wcześniej wspomnianej syntezie użyć zamiast zabezpieczonej glicyny, zabezpieczoną D-alaninę, otrzymamy w łańcuchu dwa centra asymetrii.

Rys.30. „Space’er” alifatyczny zawierający dwa centra asymetrii

Powstaje gotowy łańcuch do spięcia dwóch cząsteczek bezwodnika kwasu 1,8-naftalenodikarboksylowego. [3]

Podobną syntezą jest kondensacja II-rzędowych amin z chloroacetonitrylem w acetonitrylu w obecności węglanu potasu. [3]

Następnie redukcja glinowodorkiem litu w eterze dietylowym daje nam dwie terminalne grupy aminowe. [3]

Ostatnia omawianą grupą łańcuchów bocznych interkalatorów będą pochodne cukrowe.
Mają one głównie zastosowanie w interkalatorach typu „general bases”, obecne są również w nukleozydach antracyklinowych np. w doksorubicynie.
Główny trend w projektowaniu tego typu układów jest taki by uzyskać zabezpieczony cukier posiadający na węglu anomerycznym grupę alkilową z terminalną grypą aminową.
Pierwszym etapem jest tritylowanie z konwersją pierścienia 2-deoksy-D-rybopiranozy do 5-O-tritylo-2-deoksy-D-rybofuranozy.

Reakcja przebiega z wydajnością sięgającą 60%. [12]
W kolejnym etapie przeprowadza się reakcję „Wittiga” na węglu anomerycznym z użyciem cyjanometylofosforanu dietylu, w bezwodnym THF i wodorkiem sodu. [12, 13]

Już po pierwszym etapie tworzy się mieszanina anomerów ? i ?, które po reakcji Wittiga rozdziela się na poszczególne anomery.
Redukcje grupy nitrylowej do aminowej przeprowadza się borowodorkiem sodu z dodatkiem chlorku kobaltu, lub borowodorem w siarczku dimetylu i THF. [12, 13]

Tak otrzymaną część cukrową można poddać kondensacji z bezwodnikiem kwasu 1,8-naftalenodikarboksylowego, a po rozszczepieniu zabezpieczenia tritylowego otrzymujemy gotowy interkalator.

6. Podstawowe informacje na temat właściwości fluorescencyjnych interkalatorów naftalimidowych

Rozpatrując interkalatory jako potencjalne czynniki diagnostyczne, zdolne do świecenia po uprzednim pobudzeniu promieniowaniem UV, musimy zastanowić się nad tym jaką budowę muszą one posiadać.
Jak wiadomo za barwę związku odpowiadają układy wiązań podwójnych, a w zasadzie orbitali typu p (tzw. grupy chromoforowe), a wzmacniać lub osłabiać ją mogą ugrupowania auksochromowe jak C–Br, C–NH₂, etc. W zależności od rodzaju ugrupowań znajdujących się w związku, obserwujemy różnego typu przejścia elektronowe [14].

Tab. 2. Klasyfikacja przejść elektronowych [14].

Przejście	Charakterystyka	Zakres widma
N -> V	z orbitalu wiążącego w stanie podsta–wowym na orbital o wyższej energii: a) s -> s* b) p -> p*	nadfiolet próżniowy, nadfiolet
N -> Q	z niewiążącego orbitalu atomowego na orbital o wyższej energii: a) n -> s* b) n -> p*	bliski nadfiolet i obszar widzialny, daleki nadfiolet i czasem bliski
N -> R	z orbitalu w stanie podstawowym na jeden z orbitali o bardzo wysokiej energii (w kierunku jonizacji cząsteczki)	nadfiolet próżniowy

Interkalatory naftalimidowe posiadają w swojej cząsteczce zarówno układ skondensowanych pierścieni aromatycznych, jak i chromofory typu C=O oraz, w zależności od modyfikacji grupy auksochoromowe, jak C–OH, C–NH₂, C–X (gdzie X – fluorowiec), itp.
W tego typu związkach mamy do czynienia głównie z przejściami typu: p -> p*, n -> p* oraz n -> s* [14].
Elektrony wiązania zdelokalizowanego układu aromatycznego, grup karbonylowych oraz wolne pary atomów tlenu, azotu itp., zostają wzbudzone i widmo absorpcyjne związku będzie znajdowało się w zakresie bliskiego nadfioletu lub obszaru widzialnego.

Rys. 30. Przykładowe widmo naftalenu (1) i antracenu (2) w alkoholu [14].

Jak widać na rys. 30, naftalen i antracen, nie posiadają tylko jednego ostrego pasma absorpcji, lecz kilka charakterystycznych pików. W zależności od rodzaju grup funkcyjnych znajdujących się w związku pasmo absorpcji będzie przesuwało się w kierunku fal dłuższych, (przesunięcie batochromowe), lub krótszych (przesunięcie hipsochromowe).
Za przesunięcia batochromowe odpowiadają przejścia elektronowe typu p -> p*, czyli takie grupy jak C=O, C=S, N=N itp., natomiast za przesunięcia hipsochromowe odpowiadają przejścia elektronowe typu n -> p*, zatem takie grupy jak OH, NH₂, etc.
Należy także wspomnieć, że za efekt przesunięcia maksimum absorpcji odpowiada także rozpuszczalnik. Efekt ten, nazywany jest efektem rozpuszczalnikowym i w ogólnym zarysie przedstawi się on tak, iż pasma n -> p* w miarę wzrostu polarności rozpuszczalnika przesuwają się w kierunku fal krótszych, pasma p -> p* w miarę wzrostu polarności zazwyczaj przesuwają się w kierunku fal dłuższych.

Rys. 31. Efekty rozpuszczalnikowe w widmie tlenku mezytylu: w heptanie (I), w etanolu (II) i w wodzie (III) [14].

Pochłonięte promieniowanie musi być wydzielone podczas powrotu cząsteczki do stanu podstawowego. Promieniowanie może być wydzielone pod postacią światła lub ciepła (bezpromieniście). My zajmiemy się tą pierwszą.
Promieniste oddanie energii wzbudzenia nazywamy fluorescencją lub fosforescencją. Z fluorescencją mamy do czynienia gdy cząstka pobudzona do wyższego poziomu energetycznego (S’) przechodzi do poziomu podstawowego (S). Z fosforescencją mamy do czynienia gdy cząstka pobudzona do wyższego stanu energetycznego obniża swą energię bezpromieniście do poziomu (T’) – wyższego od poziomu podstawowego (S) a następnie promieniście z poziomu T’ do poziomu S.

Rys. 32. Schemat przejść elektronowych i towarzyszących im procesów świetlnych [14].

Po obniżeniu swej energii do poziomu T’ może nastąpić wzbudzenie termiczne do poziomu S’, a następnie przejście do stanu podstawowego S. Taki proces nazywamy opóźnioną fluorescencją.
Powrót ze stanu S’ do S – fluorescencja – następuje najczęściej dość szybko i wynosi ok. 10^–9 s. Przejście ze stanu S’ do T’ a następnie do stanu podstawowego S (fosforescencja), może trwać dłużej, nawet do 10^–3 s [14].
Długość fali promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większa niż promieniowania wzbudzającego. Tak więc fluorescencja fioletowe jest wzbudzana przez promieniowanie nadfioletowe, fluorescencja zielona – przez światło niebieskie, czerwona – przez pomarańczowe etc.
Widma fluorescencyjna są na ogół takie same, lub zbliżone do widm absorpcyjnych. Badanie widma fluorescencyjnego dostarcza nam takich samych informacji strukturalnych jak widmo absorpcyjne. Symetrię widm absorpcyjnych i fluorescencyjnych przedstawiono na rys. 33.

Rys. 33. Widma absorpcyjne i fluorescencyjne fluoresceiny (a) i antracenu (b) [14].

Niektóre związki mogą nie mieć zdolności do luminescencji po wcześniejszym wzbudzeniu do stanu wyżej energetycznego. Powodem tego typu zachowania jest tzw. predysocjacja.
Jeśli w otoczeniu chromoforu znajduje się grupa, której energia wiązania jest porównywalna lub mniejsza od energii wzbudzenia, może nastąpić jej oddysocjowanie. Zjawisko te nazywamy predysocjacją. Przykładowo – podstawienie cząsteczki benzenu atomami F, Cl, Br i I obniża fluorescencję w takim porządku. Jodobenzen praktycznie nie fluoryzuje (prawdopodobnie ulega on predysocjacji).
Podobnie jest w przypadku podstawienia grupami nitrowymi która całkowicie eliminuje fluorescencję, ponieważ powoduje szybkie rozpraszanie energii wzbudzenia elektronowego. Ponadto wiązanie, które grupa NO2 tworzy z pierścieniem benzenowym, ma dość niską energie i fakt ten powoduje uprzywilejowanie predysocjacji [14].
Połączenie pierścienia z rdzeniem heterocyklicznym powoduje przesunięcie batochromowe, zatem interkalator naftalimidowy (benzo[de]izochonolino–1,3–dionowy), fluoryzuje w zależności od dodatkowych podstawników w bliskim nadfiolecie lub świetle widzialnym. 6–nitro–2–(4–metoksyfenylo)benzo[de]izochinolino–1,3–dion wykazuje maksimum absorpcji przy l_A=436–437 nm, natomiast maksimum dla fluorescencji obserwujemy przy l_F=523–524 nm [15].
Tak więc po interkalatorach naftalimidowych możemy spodziewać się fluorescencji w zakresie widzialnym, co w rzeczywistości się obserwuje.

7. Literatura

[1] M. F. Brana, M. Cacho, A. Gradillas, B. de Pascual-Teresa and A. Ramos; Curr. Pharm. Des., 2001, 7, 1745-1780.
[2] U.B. Christensen, M. Wamberg, F.A.G. El-Esssawy, A. El-Hamid Ismail, C.B. Nilsen, V.V. Filichev, C.H. Jessen, M.Petersen and E.B. Pedersen, Nucleosides, Nucleotides & Ncleic Acids, 2004, 22, 207-225.
[3] M. F. Brana, and A. Ramos, Curr. Med. Chem. , 2001, 1, 237-255.
[4] http://chemistry.gsu.edu/faculty/Dixon/Dixon.html
[5] D. Ossipov, S. Gohil, and J. Chattopadhyaya; J. Am. Chem. Soc. , 2002, 124, 13416-13433.
[6] D. Loackes, Nucleic Acids Research; 2001, 29, 2437-2447.
[7] M.J. Warning, A. González, A. Jiménez and D.Vázquez; Nucleic Acids Research, 1979, 7, 217-230.
[8] J. Kuszmann, E. Tomori and I. Meerwald, Carbohydrate Research. , 1984, 128, 87-99
[9] J.G. Buchman, D.A. Craven, R.H. Wightman and M.R. Harned, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1991, 195-202.
[10] C.R. Schmid, J.D. Bryant, M. Dowlatzadeh, J.L Philips, D.E. Prather, R.D. Schantz, N.L.Sear and C.S. Vianco, J. Chem. Org, 1991, 56, 4056-4058.
[11] J. Suwiński, W. Sczepankiewicz, K. Świerczek and K. Walczak, Eur. J. Chem. Org. , 2003, 1080-1084.
[12] J.H. Boal, A. Wilk, C.L. Scremin, G.N. Gray, L.R. Phiips and S.L. Beaucage, J. Org. Chem. , 1996, 61, 8617-8626.
[13] C.L. Scremin, J.H. Boal, A. Wilk, L.R. Philips, L. Zhou and S.L. Beaucage, Tetrahedron Lett. , 1995, 36, 4953-8956.
[14] C.N.R. Rao; Spektroskopia elektronowa związków organicznych. Widma w nadfiolecie i zakresie widzialnym., PWN, Warszawa 1982.
[15] I. Grabchev, I. Moneva, V. Borinov and S. Guittonneau; J. Mater. Chem., 2000, 10, 1291–1296.